KORONSKA KRIZA POD DROBNOGLEDOM EMPIRIČNE ZNANOSTI

Zbornik člankov strokovnega posveta, Ljubljana, junij 2021

POVZETEK ČLANKA

UPORABA qPCR TESTOV ZA DETEKCIJO SARS-CoV-2 V SLOVENIJI

Avtor: Žiga Zebec, PhD, raziskovalec na področju mol. mikrobiol.

Povzel: Blaž Filipič, uni. dipl. bioteh.

1.    PROBLEMATIKA UPORABE qPCR TESTOV ZA DIAGNOSTIKO SARS-CoV-2

·      »Corman - Drosten test« je s strani WHO priznan kot "zlati standard" za detekcijo virusa SARS-CoV-2 . Pri tem testu se odvzame bris, izolira celokupni RNK, ki se nato obratno prepiše v komplementarni DNK (cDNK) in se kvantificira s PCR analizo (qPCR). Ta test, ki se trenutno izvaja po svetu in v Sloveniji, ima številne pomanjkljivosti.

o   Začetni oligonukleotid, kratek kos enovijačnega dednega materiala (nadalje "primer") RdRp_SARSr-R se na 12. poziciji slabo prilega viralni sekvenci.

o   Zaradi slabih termodinamičnih lastnosti primerja RdRp_SARSr-R se limit detekcije zviša na 1000 molekularnih enot viralnega cDNK.

o   Meja za pozitiven rezultat qPCR testa ali pražni cikel (Ct), ki je pri nas določen za Ct 37, predstavlja tveganje za napačne rezultate. Nove študije so namreč pokazale, da z brisom, ki je imel Ct višji od 34, ni več možno inficirati celične kulture in izolirati virusa.

o   Mikrobiom (skupek vseh mikroorganizmov), ki ga odvzamemo z brisom je kompleksen vzorec, v katerem se nahajajo tudi dedni materiali gliv, bakterij in virusov. Med pomnoževanjem v qPCR reakciji zato lahko pride do pomnoževanja cDNK podobnih virusov ali do formacije artefaktov, tako imenovanih kimer.  

o   Število molekul se med pomnoževanjem poveča za desetkrat v samo 1,4 cikla, za razliko od 3,3 ciklov, kot bi teoretično pričakovali. To je verjetno posledica nespecifičnega pomnoževanja zaradi generiranja in ponovnega pomnoževanja artefaktov. Slednje je potrdila tudi študija v reviji Nature, v kateri navajajo limit detekcije 1000 molekul. To pomeni, da Ct vrednosti za primer RdRp_SARSr, ki so višje kot 35 niso zanesljive za identifikacijo in kvantifikacijo virusa SARS-CoV-2. V Sloveniji je določen Ct 37.

·      POMEMBNO: Problematika qPCR testa je bistvena, saj se rezultate teh testov uporablja za generiranje statističnih podatkov (število inficiranih, število hospitaliziranih in število umrlih), ki se jih nato uporabi za določanje ukrepov za zagotovitev javnega zdravja. Posledično je zelo verjetno, da ljudje, ki so pozitivni na qPCR testu, vendar njihov Ct presega določeno vrednost, niso kužni in ne prenašajo virusa, hkrati pa ne zbolijo za težjo obliko bolezni. Uporaba qPCR testa, ki se uporablja tudi v Sloveniji, s strani proizvajalca tudi ni predvidena za diagnostične namene.

·      Na pomanjkljivosti qPCR metode za detekcijo SARS-CoV-2 je že bilo opozorjeno v pismu uredniku revije Eurosurveillance in v pozivu uglednih znanstvenikov, ki pozivajo k umiku članka Corman idr., 2020.

 

2.    RAZLIČNE MOLEKULARNE METODE IN TESTI

·      PCR je okrajšava za "Polymerase Chain Reaction" ali verižno reakcijo s polimerazo. S to metodo se pomnožuje dedni materiala (DNK). Leta 1983 jo je razvil Kary Mullis. Pri PCR reakciji se tipično naredi ok­oli 30-33 ciklov, končni produkt pa se nato analizira z uporabo barvila, ki interkalira (se vstavi) v DNK. Pri metodi se uporablja tri osnovne sestavine; matrični DNK, dva primerja in encim DNK polimerazo. Metoda poteka v treh fazah, ki predstavljajo en cikel v PCR reakciji.

o   Denaturacija DNK (pri 94-98  ̊C), odpiranje dvojne vijačnice DNK.

o   Prileganje primerjev na matrični DNK (pri 50-60  ̊C).

o   Sinteza nove vijačnice z encimom DNK polimeraza (pri 68-72  ̊C).

·      Kvantitativna PCR analiza (qPCR) poteka v realnem času (real-time PCR), tako, da se po vsakem končanem ciklu izmeri svetloba, ki jo emitira (izseva) barvilo, ki je bilo pred prvim ciklom pomnoževanja dodano PCR reakciji. PCR deluje samo na DNK molekulah, zato je potrebno vzorec, ki potencialno vsebuje viralni RNK, z encimom reverzna transkriptaza najprej prepisati iz RNK nazaj v komplementarni DNK (cDNA). Ko emitirana svetloba doseže vnaprej določen prag, se zabeleži cikel, v katerem je bil ta prag dosežen (pražni cikel/ cycle treshold, Ct). Prej kot je ta pražni cikel dosežen, večja je količina analiziranih molekul v vzorcu. V Sloveniji se za pozitivne smatrajo tisti vzorci, ki dajo signal pri 37. ciklu ali prej. Za akuratno (točno) kvantifikacijo je potrebna uporaba standardne krivulje s točno določenim številom molekul matričnega DNK. To qPCR metodo so razvili v raziskovalni skupini prof. dr. Christiana Drostna, iz klinike Charite Berlin v Nemčiji. Metoda »Corman-Drosten«, pri kateri se uporablja dva para primerjev za prileganje na dveh mestih viralnega cDNA, je qPCR test, ki je s strani WHO priznan kot »zlati standard« za detekcijo SARS-CoV-2 in se zato uporablja v večini držav po svetu, tudi pri nas.

·      Hitri AntiGenski Test ali krajše HAGT test, je test pri katerih se uporabljajo protitelesca (IgG), ki specifično prepoznajo proteine virusa SARS-CoV-2. Pri tem testu so specifična protitelesca (IgG, oznaka T) in kontrola (IgY, oznaka C) imobilizirana na membrani, na katero nanesemo vzorec (odvzet bris, ki je v raztopini). Test reagira v 15 – 20 min. Ob prisotnosti virusa SARS-CoV-2 je po 20 min vidna črta pri obeh oznakah T in C. V kolikor pa virus SARS-CoV-2 ni prisoten, je vidna črta samo pri oznaki C. Testi brez črt ali le s črto pri oznaki T je neveljaven. HAGT se validira (preveri oz. potrdi) s qPCR testom.

·      Test na protitelesa se ne uporablja za detekcijo SARS-CoV-2 pri obolelih, temveč se uporablja pri osebah, ki so covid-19 že prebolele (ali se o tem sprašujejo). Ta protitelesca so specifična za SARS-CoV-2 in predstavljajo del imunskega odziva.

 

3.    DODATNO

·      Retrospektiven pregled Ct vrednosti, v kombinaciji s potekom bolezni, bi lahko nudil ključne podatke za bolj učinkovito zdravljenje pacientov s covid-19 in boljšo strategijo zaščite javnega zdravja. Tako bi lahko zmanjšali predviden obseg ukrepov za zajezitev covid-19 in s tem tudi negativne posledice, ki jih imajo ukrepi na sicer zdravih ljudeh.

·      Nova študija nakazuje na korelacijo med količino viralnih partiklov, ki so jih detektirali v slini obolelih in potekom bolezni covid-19. Takšne in podobne študije bodo pomagale identificirati paciente, ki bi lahko imeli hujši potek bolezni covid-19 in tako omogočile hitro zdravljenje, še preden se razvijejo simptomi.

Uporabljamo piškotke, da izboljšamo vaše uporabniške izkušnje. Če nadaljujete predvidevamo da se s tem strinjate.